下面是小编为大家整理的核酸纯度检测,供大家参考。
最近重新研读了分子克隆第三版， 有一个有趣的小发现， 好像过去没听人说过。
一般测核酸浓度都是用 260nm 的光吸收值来决定， 同时用 260/280 的比值来判断有无蛋白质污染。
理想的比值是 1. 8~2. 0 左右。
分子克隆第三版专门提到这种判断核酸纯度的办法是不可靠的。
原因在于蛋白质在 260nm 的消光系数比核酸小很多， 即使有相当多的蛋白质污染， 这个比值还是接近于理想的比值。
另外，260/280 比值尤其不能用于评判寡聚核甘酸的纯度， 因为嘌呤的消光系数比嘧啶大好多， 寡聚核甘酸嘌呤嘧啶组成很可能不平均， 所以很可能出现很纯的样品260/280 比值却比较小的情况。
你所说的‘消光系数‘， 是否就是吸光值的意思？ 如果你用连续波长测过核酸的吸光度时， 就会发现， OD260,恰好是核酸吸光值最大的时候， 从 200-750,是一条曲线， 260 时是波峰， 而 280 时， 刚好是曲线下降到一半左右时的吸光值。
而恰好 280 又是蛋白质的最佳吸收值。
如果纯的核酸， 那曲线就是标准的， 260/280就是 1.8-2.0 之间， 如果混有蛋白质， 多肽， 酚之类的杂质， 那 280 时的吸收峰就变高了， 曲线随之发生变形， 而 260 时的吸收峰不变。
就如你所说的“原因在 于蛋白质在 260nm 的消光系数比核酸小很多”， 因此 260 的吸收峰几乎不变。
但 280时却不一样。
这时相反， 核酸的消化系数比蛋白质小的多， 因此， 一旦有污染，280 上升很快。
因此 260/280 在有污染的情况下就会变小。
所以， 用 260/280 的方法， 还是比较可靠的。
当然更可靠的， 就是用 200-750 的波长， 连续扫描。
直接观察核酸的整条曲线， 那比光靠 260,280 两个吸收值， 肯定要准确很多。
其实平时在我们检测时， 我们也会检测 230,320,两个值。
至于这两值的作用， 我稍后再说。
其实有 230,260,280,320,这四个点。
基本上也能确定下这条曲线的该一段的形状了。
A 260 / A 280 的比值， 用于评估样品的纯度， 因为蛋白的吸收峰是 280 nm。纯净的样品， 比值大于 1.8（DNA）
或者 2.0（RNA）。
如果比值低于 1.8 或者2.0， 表示存在蛋白质或者酚类物质的影响。
A 230 表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物， 多肽， 苯酚等， 较纯净的核酸 A 260 / A 230 的比值大于 2.0。
A 320 检测溶液的混浊度和其他干扰因子。
纯样品， A 320 一般是 0。（320 差不多也就是那条曲线刚下降到 0 的时候）。
所以， 当我们检测 260/280 后， 如果比值在 1.8-2.0 之间时， 我们可以说其纯度可以， 那 OD260 的值就有效。
否则， OD260 的值判为无效。
你说的嘌噙与嘧啶的吸光值， 确实没错。
但一般情况下， 我们测的都是基因组、 tRNA， mRNA、cDNA， 所以其 CG 含量都比较均匀。
都适用于这种方法。
然而， 在测某些 CG含量明显不均匀的情况下， 比如人工合成的寡核苷酸、 引物， 在 CG 含量过大或者过小的情况下， 我们就不能用 260/280 的方法了。
不过一般自已合成的引物，
都能保证纯度的， 买来的引物， 或者托公司合成的寡核苷酸， 也不需要我们用OD 值方法重新测一下。
因为产品包装上写着多少个 OD， 序列长度， 都非常详细， 纯度也是有保证的。
当 OD 260/ OD280 值=1.8 说明所提的 DNA 质粒的纯度比较高， 所含的 RNA或蛋白质污染很少， 当 OD 260/ OD280 值>1.8， 说明有 RNA 污染， 当 OD 260/ OD280 值<1.8 时,说明所提的 DNA 中有蛋白质或者是抽提时用的苯酚未除净，楼主所体的质粒 DNA 的 260/280 在 2.0 左右， 说明有一定的 RNA 污染， 在提质粒 DNA 中， 一般是在提完质粒后， 加入 TE 溶液时加入一定量的 RNA 酶。
抽提1.5ml大肠杆菌过夜菌液时， 最后加入20ul的 TE溶液时加入1.5ul浓度为 10mg/ml的 RNA 酶， 一般就可以完全去除质粒中所含的 RNA 污染
有关 RNA 的吸光度说明如下：
260nm、 320nm、 230nm、 280nm 下的吸光度分别代表了核酸、 背景（溶液浑浊度)、 盐浓度和蛋白质等有机物的吸光度值。
OD260/OD280（R）
体现了 RNA中的蛋白质等有机物的污染程度， 质量较好的 RNA的 R 值应在 1 .8～2.0 之间， 当 R<1 .8 时， 溶液中的蛋白质等有机物的污染比较明显； 当 R>2.2时， 说明 RNA 已经被水解成了单核苷酸。
在对核酸进行吸光度检测时， 需要注意稀释液应使用 TEBuffer。
